Stymulacja jajników podczas leczenia metodą pozaustrojowego zapłodnienia jest postępowaniem z wyboru. Zapewnia to optymalną szansę na ciążę. Pozaustrojowe zapłodnienie w tzw. cyklu naturalnym (poza rzadkimi sytuacjami u pacjentek ze złą odpowiedzią na stymulacje) nie powinno być proponowane ze względu na niską szansę powodzenia

Typy protokołów stymulacyjnych
W stymulacji mnogiego jajeczkowania stosowane są następujące protokoły stymulacyjne:

Protokoły z agonistami GnRH

• Protokół krótki
• Protokół długi
• Protokoły z antagonistami GnRH

Nie ma obecnie jednoznacznych danych potwierdzających wyższą skuteczność jednego typu protokołu stymulacyjnego u wszystkich kobiet kwalifikowanych do leczenia metodą pozaustrojowego zapłodnienia. Wybór protokołu stymulacyjnego jest sprawą indywidualną. Przed podjęciem tej decyzji powinny być wzięte pod uwagę następujące czynniki:

• Wiek pacjentki
• Rezerwa jajnikowa
• Świadomość pacjentki o korzyściach i wadach proponowanego protokołu
• Przewidywana szansa na ciążę
• Doświadczenie lekarza prowadzącego
• Chęć i możliwość współpracy pacjentki
• Ewentualne wyniki poprzednich stymulacji
• Czynniki ekonomiczne

Ogólne zasady podczas wyboru protokołu stymulacyjnego i monitorowania leczenia:

1. Kobiety o gorszym rokowaniu na zajście w ciążę u których:
   •  jest mała rezerwa jajnikowa i maleje reaktywność jajnika na gonadotropiny (kobiety powyżej 37 roku życia, palące)
   • uzyskuje się mniej prawidłowych komórek jajowych, niższe odsetki zapłodnień oraz mało lub wcale zarodków o prawidłowym potencjale rozwojowym.
2. Dawka początkowa gonadotropin może być ustalona na podstawie następujących kryteriów:
   • Pacjentki niepalące, w wieku 30-35 lat, o prawidłowej masie ciała, z wartościami FSH poniżej 10 mIU/Ml, z prawidłową liczbą pęcherzyków antralnych (5-10 w jajniku) - zalecana dawka 150 IU gonadotropin dziennie.
   • Pacjentki niepalące, w wieku poniżej 30 lat, BMI poniżej 19, powyżej 10 pęcherzyków antralnych w jajniku mogą mieć zmniejszoną początkową dawkę gonadotropin o 20 – 50%
   • Kobiety starsze, z nadwagą, palące papierosy lub z mniejszą od przeciętnej liczbą pęcherzyków antralnych mogą mieć zwiększoną wyjściową dawkę gonadotropin o 50%.
   • Dawka gonadotropin może być modyfikowana po 6 -7 dniach stymulacji
3. U pacjentek z endometriozą można rozważyć wcześniejsze (do 3 miesięcy) zablokowanie czynności osi podwzgórze – przysadka - jajnik agonistą GnRH w tzw. protokole ultradługim, a następnie rozpocząć stymulację gonadotropinami. Spowodowany w ten sposób stan hipoestrogenizmu może prowadzić do częściowej regresji ognisk endometriozy, a przez to przyczynić się do zwiększenia skuteczności leczenia. Ta opcja stymulacji jajników powinna być szczegółowo przedyskutowana z parą, a decyzja powinna być podjęta indywidualnie ze względu na ryzyko niewystarczającej odpowiedzi jajników na stymulację oraz możliwość zwiększenia kosztów stymulacji. W niektórych szczegółowych analizach nie wykazano wyższej skuteczności tego sposobu postępowania.
4. Monitorowanie stymulacji jajników powinno polegać na:
   • Ocenie ultrasonograficznej wzrostu pęcherzyków
   • Monitorowaniu stężenia estradiolu w surowicy (badanie nie zawsze jest konieczne przy każdej wizycie)
5. Zakończenie stymulacji.
6. Ze względu na ryzyko wystąpienia zespołu hiperstymulacyjnego (OHSS), gdy stężenie estradiolu przekracza 3000 pg/ml i w jajniku są bardzo liczne pęcherzyki, zaleca się przedstawienie parze metod zmniejszających ryzyko wystąpienia OHSS. Metody te mogą polegać na:
   • odczekaniu - bez podawania gonadotropin, do czasu obniżenia stężenia estradiolu
   • podaniu po punkcji antagonistów receptora D2
   • odstąpieniu od przeniesienia zarodków do macicy, zamrożeniem blastocyst
   • zakończeniu cyklu bez podawania hCG

Leki stosowane w protokołach stymulacyjnych
W stymulacji stosowane są następujące leki:

1. Analogi gonadoliberyny (GnRH)
   • preparaty krótko działające (najczęściej jednodniowe)
   • preparaty długo działające (najczęściej miesięczne)
2. Antagoniści gonadoliberyny
   • preparaty jednodniowe
   • preparaty działające 4 dni
3. Leki stymulujące wzrost pęcherzyków w jajnikach (gonadotropiny)
   • uzyskane metodą rekombinacji genetycznej
     1. preparaty rFSH,
     2. preparaty rLH
     3. preparaty mieszane rFSH i rLH
   • gonadotropiny otrzymywane z moczu kobiet po menopauzie
     1. FSH
     2. mieszane preparaty FSH i o aktywności LH
4. Leki wywołujące „farmakologiczny pik LH”
   • uzyskane metodą rekombinacji genetycznej (rhCG)
   • uzyskane z moczu kobiet ciężarnych (hCG)
   • agoniści GnRH w cyklach z antagonistą GnRH

Podczas stymulacji powinny być zastosowane leki zgodne z wybranym protokołem stymulacyjnym i doświadczeniem lekarza prowadzącego leczenie. Nie wykazano jednoznacznej przewagi konkretnego preparatu gonadotropin nad innymi we wszystkich protokołach stymulacyjnych. W związku z tym podczas wyboru preparatu należy mieć również na uwadze indywidualną sytuację kliniczną, wygodę stosowania i koszty leczenia.

Pobranie komórek jajowych
Komórki jajowe pobiera się igłą aspiracyjną przez pochwę, pod kontrolą sonograficzną, w krótkotrwałym znieczuleniu dożylnym. Przed punkcją jajników podaje się zwykle profilaktycznie antybiotyki szerokowachlarzowe (np. doksycyklinę).

Po pobraniu komórek jajowych należy pobrać plemniki. Najczęściej wykorzystuje się plemniki z ejakulatu. U mężczyzn z azoospermią i zachowaną spermatogenezą w jądrze, plemniki uzyskuje się poprzez punkcję najądrzy (PESA – Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration) lub biopsję aspiracyjną jąder (TESA Testicular Sperm Aspiration) bądź biopsję otwartą (TESE – Testicular Sperm Extraction).

Zapłodnienie i rozwój zarodka poza ustrojem
Klasyczne zapłodnienie pozaustrojowe (IVF) polega na umieszczeniu komórki jajowej w naczyniu z przygotowanymi laboratoryjnie plemnikami po kapacytacji (około 100 tysięcy plemników na komórkę jajową). Plemniki przygotowuje się metodą migracji wstępującej lub wirowania na gradientach. Komórki wzgórka jajonośnego otaczające komórkę jajową selekcjonują dostęp plemnika. Plemnik przed wniknięciem do komórki jajowej, w kontakcie z komórkami wzgórka jajonośnego, ulega reakcji akrosomalnej i potem łączy się z osłonką przejrzystą i ją penetruje. Klasyczne zapłodnienie przynosi powodzenie, jeżeli nasienie jest prawidłowe lub wykazuje tylko nieznaczne nieprawidłowości. Przy nieprawidłowych parametrach nasienia zalecaną metodą zapłodnienia jest docytoplazmatyczna iniekcja plemnika (ICSI – Intracytoplasmic Sperm Injection). Plemnik po immobilizacji zostaje wstrzyknięty bezpośrednio do komórki jajowej. Taką metodę zapłodnienia stosuje się również u par po uprzednich niepowodzeniach klasycznego IVF. Plemniki do mikroiniekcji można wybierać przyżyciowo pod dużym powiększeniem (IMSI – Intracytpolasmic Injection of Morphologically Selected Sperm).

Zapłodnienie i rozwój zarodków należy przeprowadzić w podłożach dostępnych komercyjnie, o sprawdzonych właściwościach i odpowiednim składzie, zapewniającym optymalny rozwój w inkubatorze CO2, w temperaturze 370C.

Prawidłowo zapłodnione komórki wykazują obecność dwóch przedjądrzy. W ocenie prawidłowości zapłodnienia wykorzystuje się:

• Ocenę liczby przedjądrzy
• Ocenę wielkości przedjądrzy
• Ocenę morfologicznego obrazu cytoplazmy
• Ocenę ciałek kierunkowych i ich rozmieszczenia

Prawidłowo zapłodnione zygoty rozwijają się w warunkach pozaustrojowych. Zarodki z zachowanym potecjałem rozwojowym przenosi się do jamy macicy w 2, 3 lub 5 dniu.Wiadomo, że spośród puli zarodków tylko niektóre z nich są prawidłowe i mogą implantować w jamie macicy. Zaburzenia w dojrzewaniu cytoplazmy i zaburzenia w podziale redukcyjnym gamet mają decydujace znaczenie w zaburzeniach rozwoju zarodka przedimplantacyjnego. Do transferu zarodka / zarodków do jamy macicy oraz kriokonserwacji należy wybierać tylko zarodki prawidłowe.

W ocenie prawidłowości rozwoju zarodka wykorzystuje się ocenę morfologiczną:

• Ocenę tempa podziałów
• Ocenę liczby blastomerów
• Ocenę liczby jąder w blastomerach
• Ocenę kształtów blastomerów, wielkości, regularności
• Ocenę stopnia fragmentacji

Dwublastomerowy zarodek pojawia się w 25 - 28 godzinie po zaplemnieniu. Najlepiej rokują zarodki wcześnie wchodzące w pierwszy podział mitotyczny. Czteroblastomerowy zarodek można zaobserwować 42 - 44 godziny po zaplemnieniu a ośmioblastomerowy zarodek 66 - 68 godzin po zaplemnieniu. Zarodki dzielące się asynchronicznie implantują w jamie macicy rzadziej. W 2 dobie około 12 – 27% zarodków ma blastomery wielojądrzaste. Odsetek ten zmniejsza się w 3 dobie. Zaobserwowano, że tylko 16% zarodków z jednym lub więcej blastomerami rozwija się do blastocysty. Zarodki takie 2-krotnie rzadziej implantują, a ryzyko poronienia po implantacji takich zarodków jest dużo większe. Wielojądrzastość blastomerów towarzyszy aneuploidii zarodków. Ważnym parametrem w ocenie jakości zarodka jest kształt, wielkość i regularność blastomerów. Zarodki z nierównymi blastomerami o różnych ksztaltach źle rokują co do prawidłwego rozwoju i implantacji. Część zarodków w kolejnych dniach rozwoju zatrzymuje się w rozwoju i blastomery nie przechodzą dalszych podziałów. Źle rokują również zarodki hyperaktywne o szybszym podziale i większej liczbie blastomerów niż wynikałoby to z fazy rozwojowej.

Rozwój zarodka w warunkach pozaustrojowych można przeprowadzić do stadium blastocysty – wymaga to stosowania podłóż sekwencyjnych. Rozwój do stadium blastocysty można traktować jako swoistą próbę jakości zarodka, ale stadium to mogą osiągać również zarodki nieprawidłowe. W ocenie jakości blastocysty wykorzystuje się:

• ocenę stopnia rozwoju jamy blastocysty
• liczbę i jakość komórek trofoblastu
• morfologiczną ocenę węzła zarodkowego.

Powszechnym zjawiskiem w zarodkach ludzkich jest zjawisko fragmentacji, czyli tworzenia się bezjądrzastych fragmentów cytoplazmy. Stopień fragmentacji w dużym stopniu koreluje z potencjałem do zagnieżdżenia. Zarodki z dużymi fragmentami mają niższe odsetki rozwoju do blastocysty i bardzo niskie odsetki implantacji w porównaniu do zarodków z drobnymi fragmentami. Stopień nasilenia fragmentacji koreluje z mozaicyzmem chromosomalnym, poliploidią i haploidią; nie koreluje z aneuploidią.

Wraz z wiekiem kobiety fragmentacja zmniejsza się, ale potencjał rozwojowy zarodków jest mniejszy. Fragmentacja jest procesem dynamicznym; niektóre fragmenty mogą być ponownie włączone do blastomerów. Wraz ze zwiększaniem się stopnia fragmentacji dochodzi do dezorganizacji rozwoju zarodka.